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γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamic acid）是一種重要的天然聚合物，由 于其具有良好的性質(zhì)已被廣泛應(yīng)用于食品，化妝品，醫(yī)藥，材料等領(lǐng) 域。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）LL3 是一株谷氨酸 非依賴型 γ-PGA 合成菌。為了提高其 γ-PGA 產(chǎn)量，項(xiàng)目組采用無痕 基因編輯技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行了代謝工程改造。包括三部分：模塊化代謝 通路改造；蔗糖代謝途徑改造；谷氨酸合成途徑改造。 B. amyloliquefaciens LL3 是項(xiàng)目組從發(fā)酵食品中分離得到，它能 夠從蔗糖出發(fā)合成 γ-PGA。利用模塊化通路改造策略對(duì) γ-PGA 合成 相關(guān)的八個(gè)代謝通路進(jìn)行改造包括：γ-PGA 降解相關(guān)途徑；細(xì)胞呼吸 鏈；胞外蛋白及胞外蛋白酶合成途徑；細(xì)菌多糖合成途徑；次級(jí)小分 子代謝產(chǎn)物合成途徑；細(xì)胞自誘導(dǎo)因子合成途徑；谷氨酸合成途徑以 及 γ-PGA 合成途徑。最終整合獲得的最優(yōu)基因工程菌株 NK-anti-rocG （敲除了 epsA-O 操縱子（負(fù)責(zé)胞外多糖合成），sac 操縱子（負(fù)責(zé)果 聚糖合成），lps（脂多糖合成相關(guān)），pta（乙酸合成相關(guān)），pgdS（γ-PGA 降解酶），cwlO（細(xì)胞壁水解酶），luxS（AI-2 合成）以及表達(dá) anti-rocG sRNA（抑制谷氨酸脫氫酶表達(dá)））γ-PGA 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量從 3.8 g/L 提高到 11.04 g/L，較對(duì)照菌株提高了 2.91 倍。γ-PGA 產(chǎn)物純度也 從 78.6%提高到 95.2%。5-L 罐補(bǔ)料分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)得到 NK-anti-rocG 菌株產(chǎn)量可達(dá) 20.3 g/L。分子量 450,000 Dal，純度 95%以上。 項(xiàng)目特色： 1. 菌種（Bacillus amyloliquefaciens）LL3 是谷氨酸非依賴型 γ-聚谷 氨酸合成菌株；發(fā)酵生產(chǎn)主要原料為蔗糖； 2. 補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)量為：20.3 g/L。 3. 授權(quán)專利號(hào)為：ZL200810053900.7 市場(chǎng)應(yīng)用前景： γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamic acid）是一種重要的天然聚合物，由 于其具有良好的性質(zhì)已被廣泛應(yīng)用于食品，化妝品，醫(yī)藥，材料等領(lǐng) 域。本項(xiàng)目采用谷氨酸非依賴型 γ-聚谷氨酸合成菌做為發(fā)酵菌種，以 蔗糖為原料發(fā)酵法生產(chǎn) γ-聚谷氨酸，可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效 益。

已有樣品/n微生物法生產(chǎn)天然香料α-松油醇技術(shù)?！　〕晒?jiǎn)介：α-松油醇(FEMA 3045)有穩(wěn)定的丁香花、鈴蘭花等花香香氣，是我國重要的出口香料品種，可用于調(diào)配檸檬、甜橙、桃子、柑橘等食用香精。α-松油醇天然存在于柑橘精油、松節(jié)油、桉葉油、迷迭香油等多種植物精油中，但在精油中的天然含量一般較低，因而實(shí)際使用的α-松油醇主要來源于化學(xué)合成。本成果突破現(xiàn)有技術(shù)以化學(xué)合成法生產(chǎn)α-松油醇的技術(shù)瓶頸，提供一種微生物法生產(chǎn)香料α-松油醇的方法，通過該法生產(chǎn)的香料屬于天然香料，克服了化學(xué)合成法存在的安全性問

(1) 針對(duì)有機(jī)化工廢水毒性強(qiáng)、難生物降解的特征，通過非均相 Fenton 氧化，將難降解的污染物轉(zhuǎn)化為易生物處理的物質(zhì)之后與固定化微生物聯(lián)用，提高有機(jī)化工廢水效率和降低成本，探討化工廢水中典型有機(jī)污染物的催化氧化降解和生物降解的相互影響機(jī)制，對(duì)于控制化工廢水對(duì)環(huán)境的污染具有重大的理論意義和實(shí)用價(jià)值；(2)設(shè)計(jì)制備磁性微納米非均相 Fenton 催化材料，具有比表面積大、擴(kuò)散阻力小、表面活性高等特性，能高效誘導(dǎo)產(chǎn)生羥基自由基，將難降解有機(jī)污染物降解為 CO2、H2O 和其他礦物鹽，整個(gè)過程綠色、無二

一、成果簡(jiǎn)介 食源性病原微生物目前是威脅我國食品安全的首要風(fēng)險(xiǎn)。通過分子生物學(xué)手段可快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)的檢測(cè)病原微生物，但傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中只能做到靶向檢測(cè)和事后檢 測(cè)，即在例行檢查中只檢測(cè)種類有限的常規(guī)病原微生物，而不在常規(guī)檢測(cè)范圍內(nèi)的病原微生物在爆發(fā)食品安全事件后才進(jìn)行檢測(cè)，這種靶向性和后驗(yàn)性導(dǎo)致食源性病原微生物檢測(cè)的遺漏和滯后。另 外，傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)一次實(shí)

微生物菌制劑處理禽畜糞便，使禽畜糞便無臭味，進(jìn)一步把大分子有機(jī)物發(fā)酵降解為小分子有機(jī)物，使植物更容易吸收利用。在高溫發(fā)酵階段溫度可達(dá)60～70℃，經(jīng)過發(fā)酵處理的雞糞變?yōu)闊o病毒、無蟲卵、無害蟲的衛(wèi)生肥料。變臭糞為綠色食品生產(chǎn)的上等肥料，既改善環(huán)境又增加了有機(jī)肥資源。特別適合養(yǎng)雞戶多的縣，或者大的養(yǎng)雞廠，具有很高的經(jīng)濟(jì)效益、環(huán)境效益。微生物菌制劑凈化養(yǎng)殖水，也可以凈化景觀用水，比如旅游地的湖泊、水庫、河流受到污染，或者城市公園的水富營養(yǎng)化等都可以用本菌制劑治理，達(dá)到污水變清、保護(hù)水資源的

研發(fā)階段/n本成果在國內(nèi)首次建立了能同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物尿中青霉素類、頭孢菌素類、氨基苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類和林可霉素等抗菌藥物殘留的微生物學(xué)快速篩選方法。本法對(duì)各類藥物的檢測(cè)限均低于或等于國家規(guī)定的最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。通過系列工藝研究及放大試驗(yàn)、穩(wěn)定性考察、動(dòng)物給藥及殘留實(shí)樣考核等研究，研制的試劑盒假陰性率為0，假陽性率為7%以下，保質(zhì)期不低于6個(gè)月，與國外同類產(chǎn)品相比，該試劑盒的靈敏度、假陽性率、假陰性率和重現(xiàn)性等更好。技術(shù)水平：鑒定成果（成果鑒定號(hào)：農(nóng)科果鑒字（2008）第52號(hào)，該成果總體

氮、磷過度排放導(dǎo)致的水體富營養(yǎng)化成為全球水環(huán)境面臨的挑戰(zhàn)之一，特別是由此引發(fā)的藍(lán)藻爆發(fā)、水體生態(tài)功能喪失及飲用水資源危機(jī)成為各國政府亟待解決的關(guān)鍵問題。如何實(shí)現(xiàn)氮磷營養(yǎng)鹽的合理分配和調(diào)控，成為防止水體富營養(yǎng)化和構(gòu)建完善的水體生態(tài)系統(tǒng)的核心和關(guān)鍵。微生物活化設(shè)備照片 同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院柴曉利教授團(tuán)隊(duì)研發(fā)的水體微生物活化技術(shù)，突破了傳統(tǒng)旁通水處理工藝、水生動(dòng)植物修復(fù)技術(shù)的不足，通過激活土著優(yōu)勢(shì)菌種，使之快速增殖，打破原有水體微生態(tài)平衡，用水體本身容積代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有限生物反應(yīng)器，大大增加微生物的增殖空間，充分發(fā)揮微生物對(duì)污染物的削減能力，改善生態(tài)系統(tǒng)賴以生存的透明度、營養(yǎng)鹽等不利條件，重組、完善水體微生態(tài)系統(tǒng)，恢復(fù)水體自凈能力，最終脫離人工干預(yù)回歸自然，具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。 基于微生物調(diào)控的水體原位修復(fù)技術(shù)解決了地表水環(huán)境輕度污染水體（富營養(yǎng)化）治理的技術(shù)瓶頸，引領(lǐng)了低污染負(fù)荷飲用水水源地氮素污染控制技術(shù)的發(fā)展方向，具有重要的社會(huì)環(huán)境效益。目前該技術(shù)已經(jīng)獲得相關(guān)授權(quán)專利11項(xiàng)，在全國十幾個(gè)省市30多個(gè)水生態(tài)修復(fù)工程項(xiàng)目中得到了推廣應(yīng)用，累積項(xiàng)目合同額超過3億元。

手性氨基酸作為最重要的原料和中間體，市場(chǎng)規(guī)模也越來越大。本項(xiàng)目研發(fā)的手性氨基酸包含 L-2-氨基丁酸、D-蘇氨酸、L-天冬酰胺、L-叔亮氨酸、L-色氨酸等。2-氨基丁酸是一種非天然的氨基酸，是一種重要的化工原料，被用作為多種手性藥物合成中的重要中間體，包括抗結(jié)核藥物乙胺丁醇、布瓦西坦和抗癲癇 藥物左乙拉西坦。D-蘇氨酸是天然氨基酸 L-蘇氨酸的光學(xué)異構(gòu)體，是一種非天然氨基酸。主要應(yīng)用于手性藥物、手性添加劑和手性助劑等領(lǐng)域，在制藥行業(yè)作為手性合成的手性源，主要用于生產(chǎn)新型光譜抗生素、D-蘇氨醇和多肽合成過程的蘇氨酸保護(hù)劑。L-天冬酰胺是常見的 20 種氨基酸之一，在食品、醫(yī)藥、化工合成、微生物培養(yǎng)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。L-天冬酰胺可以作為添加劑用于清涼飲料,同時(shí)在腫瘤治療及蛋白質(zhì)糖基化中扮演重要角色。L-天冬酰胺常用于氨基酸輸液，以及具有降壓、平喘、抗消化性潰瘍、胃功能障礙等功能，并可用于治療心肌梗死、心肌代謝障礙、心力衰竭、心臟傳導(dǎo)阻滯、疲勞癥等。此外，L-天冬酰胺也是微生物培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)重要的添加劑。L-叔亮氨酸是一種非蛋白原的手性氨基酸, 由于叔丁基的空間位阻大, 叔亮氨酸的衍生物可在不對(duì)稱合成中作為誘導(dǎo)不對(duì)稱的模板。隨著不對(duì)稱合成的發(fā)展, 叔亮氨酸的應(yīng)用也非常廣泛。又由于占空間大的叔丁基鏈及其疏水性, 它在多肽的合成中能夠很好地控制分子構(gòu)象, 增加多肽的疏水性和受酶降解的穩(wěn)定性, 因此在藥物和生物應(yīng)用中正迅速地發(fā)展, 用于抗癌、抗艾滋病等藥物和生物抑制劑及肽等。

L-甲硫氨酸廣泛應(yīng)用于飼料業(yè)，是家禽飼料中首選的限制性氨基酸。L-甲硫氨酸是強(qiáng)肝解毒劑、促進(jìn)發(fā)育劑，當(dāng)缺乏時(shí)會(huì)引起食欲減退。甲硫氨酸廣泛應(yīng)用于營養(yǎng)補(bǔ)充與畜產(chǎn)飼料，由于甲硫氨酸容易被雞吸收而轉(zhuǎn)變?yōu)殡u肉蛋白，在雞飼料中添加甲硫氨酸，可少耗飼料，并使雞肉生長(zhǎng)健全。L-甲硫氨酸合成方法主要為化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法兩種。因化學(xué)合成法會(huì)產(chǎn)生大量有害物質(zhì)，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甲硫氨酸越來越受到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)室以谷氨酸棒狀桿菌為出發(fā)菌株，通過代謝工程技術(shù)手段進(jìn)行基因敲除和敲入，以達(dá) 到“開源節(jié)流”，即增強(qiáng) L-甲硫氨酸合成路徑代謝流，抑制或阻斷旁路途徑代謝流，最終提高 L-甲硫氨酸產(chǎn)率，目前中間菌株產(chǎn)率已達(dá) 21 mmol/L，具有重要的應(yīng)用前景。 

L-蘇氨酸在食品、飼料、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的用量呈長(zhǎng)期穩(wěn)定增長(zhǎng)趨勢(shì)，尤其在飼料添加劑中增長(zhǎng)最為迅速。以添加了 L-蘇氨酸的低蛋白配方飼料作為家禽日糧，不但可以緩解天然蛋白的匱乏，減少動(dòng)物氨的排放，還能提高家禽的生產(chǎn)性能。而在醫(yī)藥領(lǐng)域，L-蘇氨酸除了用于氨基酸輸液之外，隨著人類保健意 識(shí)的提高，各類氨基酸保健飲品涌現(xiàn)市場(chǎng)，L-蘇氨酸是必不可少的配方成分。L-蘇氨酸有望取代色氨酸，成為繼賴氨酸和甲硫氨酸之后第三大發(fā)展最迅速的氨基酸。因此 L-蘇氨酸產(chǎn)業(yè)迫切需要提高產(chǎn)量，降低成本，以滿足市場(chǎng)需求。本實(shí)驗(yàn)室以谷氨酸棒狀桿菌為出發(fā)菌株，通過代謝工程技術(shù)手段進(jìn)行基因敲除和敲入，對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行了測(cè)序、蛋白結(jié)構(gòu)解析及定向改造，以達(dá)到“開源節(jié)流”，即增強(qiáng) L-蘇氨酸合成路徑代謝流，抑制或阻斷旁路途徑代謝流，最終提高L-蘇氨酸產(chǎn)率近 20 倍，具有較好的應(yīng)用前景。