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本發明涉及一種利用噬菌體PhiX174的E基因和葡萄球菌核酸酶A基因轉化制備鴨疫里默氏菌前菌影疫苗的方法與應用方法。該方案首先將噬菌體PhiX174的E基因和葡萄球菌核酸酶A基因通過柔性連接臂(Gly4Ser)3連接成串聯基因，并進一步構建溫控表達載體pBV-E-SN。將pBV-E-SN電擊轉化進入鴨疫里默氏菌原生質體，篩選陽性克隆28℃增菌培養。分離菌體加保護劑后分裝、冷凍干燥。本發明所制備的活菌疫苗經飲水免疫，既可以刺激呼吸道和消化道黏膜的局部免疫，也可以激發體液免疫。

茶葉是我國重要的農產品之一， 也是傳統的大宗出口商品。在茶葉種植中，以氯氝菊酣為主

成果與項目的背景及主要用途： 菌糠是指以棉籽殼、木屑、稻草、玉米芯、甘蔗渣及多種農作物秸稈、工業 廢料（如酒糟、醋糟、造紙廠廢液及制藥廠黃漿廢液等）為主要原料栽培食用菌 后的廢棄培養基。菌糠主要含有物質是纖維素、半纖維素、木質素、抗營養因子 和少量的蛋白質，這些原料作為培養基栽培食用菌后，通過食用菌菌體的生物固 氮作用、酶解作用等一系列生物轉化過程，粗蛋白質、粗脂肪含量均比不經過食 用菌發酵前提高二倍以上，纖維素、半纖維素、木質素等均已被不同程度的降解， 其中粗纖維素降低了 50%以上，木質素降低 30%以上，棉酚降低 60%以上，同 時還產生了多種糖類、有機酸類和生物活性物質。據報道，我國菌糠年產量在 200 萬噸以上大部分當作廢料而被浪費掉，給環境造成了很大的污染，一些菌糠 可以被用作畜禽飼料，并且用廢棄菌糠來改良土壤可以做到廢物利用、改善環境， 實現農業的可持續發展。 我國土壤絕大部分嚴重缺磷、缺鉀，化學肥料中的磷元素和鉀元素在施肥后 很快被固化，不再能夠被植物使用。解磷菌、解鉀菌及固氮菌是生物益生菌肥中 的主要菌株，使用這些土壤益生菌可以提高土壤中植物可利用氮磷鉀的利用率。 如果能夠利用廢棄菌糠大規模培養這三種菌，制備成為生物菌肥，將會極大的增 211天津大學科技成果選編 加菌糠做為肥料的優勢。本項目利用菌糠培養解磷菌、解鉀菌、固氮菌，制備成 為生物菌肥，預期產生極大的經濟效益和社會效益。 技術原理與工藝流程簡介： 本項目擬利用處理后的廢棄菌糠殘渣培養酵母、解磷菌、解鉀菌、固氮菌， 優化發酵條件，提高菌體量，獲得制備微生物菌肥的最佳工藝路線。 天津大學從農業廢棄物堆肥中篩選出 7 株解磷能力較強的菌株，其中菌株 FL7 表現出較好的解磷效果，FL7 解磷量為 436.63mg/L。該菌株已經于 2010 年 7 月 13 日在中國微生物菌種保藏中心進行保藏（保藏號：CGMCC NO.4008）。 本課題組還從農業廢棄物堆肥中篩選得到解鉀菌 K3、固氮菌 N1。解鉀菌 K3 解 鉀量達 4.10mg/L、固氮菌 N1 固氮量為 1.81×10—2mol/L。 另外，天津大學已經建立了以菌糠為基質培養解磷、解鉀、固氮菌的發酵條 件，經過發酵條件優化，制備的菌肥中三種菌的含量達到 48.62×108CFU/g，其 中解磷菌 2.4×108cfu/g，解鉀菌 25.22×108cfu/g，固氮菌 21×108cfu/g，均遠高于 國標。 應用領域：生物、農業領域 合作方式及條件：具體面議

有很高的食用和藥用價值，是我國傳統的藥用真菌之一。其鮮嫩醇香，肉 質細嫩、潔白如玉、口感獨特、生熟皆可食、食藥兩用、營養豐富。雞樅菌中 含有麥角甾醇類物質及治療糖尿病的有效成份，對降低血糖有明顯效果。并有 抑制人體癌細胞生長的作用。 

本發明的目的在于提供了一種裝載具有干擾素誘導活性的聚肌胞苷酸，并加入殼寡糖作為佐劑的鴨疫里默氏菌菌影疫苗。該方案首先構建溫控表達載體，電轉化入鴨疫里默氏菌原生質體，篩選陽性克隆后28℃增菌培養，然后42℃誘導裂解基因的表達，待OD600不再降低時，加入聚賴氨酸繼續作用以充分裂解活菌，然后離心分離菌體。將干燥菌體與6mg/mL的聚肌胞溶液等比例混合，使聚肌胞包埋進入菌影內，然后加入2%殼寡糖水溶液攪拌形成均一的混合物，分裝于西林瓶，冷凍干燥，即得到鴨疫里默氏菌新型菌影疫苗。本發明所制備的菌影疫苗經飲水免疫，既可以刺激呼吸道和消化道黏膜的局部免疫，也可以激發體液免疫，對機體的保護效果與注射免疫無明顯差異。

鹽脅迫直接影響植物的生長，我國現有約9913萬公頃的鹽堿土地，占全國可用耕地面積近四分之一，無法進行大規模農作物種植。植物耐鹽堿促生菌可以通過調節土壤pH值，促進植物對營養物質的吸收，調節植物激素，調節植物耐受氧化和滲透脅迫的能力等，幫助植物抵抗鹽堿脅迫在逆境下生長增產。 對于耐鹽堿促生菌Bacillus subtilis N51和Bacillus cereus T146，實驗室現通過連續發酵，優化發酵工藝以及噴霧干燥工藝，制備孢子形成率達70%以上、干粉菌劑活菌數目達1010/g的菌劑。 對于菌株Kocuria sp. LA1T6、Bacillus sp. LA1T8和Pseudomonas sp.T44，實驗室現進行多糖包衣制劑的開發，研制高穩定性、成膜性、安全性和緩釋性的包衣制劑。

技術分析（創新性、先進性、獨占性） （1）耐藥菌感染已經成為危害公共安全和人類健康的重大疾病 近年來，隨著抗菌藥物的增加和廣泛應用，細菌耐藥性問題日益突出，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、耐青霉素肺炎鏈球菌(PRSP)、耐萬古霉素腸球菌(VRE)、產超廣譜β-內酰胺酶(ESBL)腸桿菌、多種耐藥性結核桿菌(MDRMT) 等超級耐藥致病菌相繼產生和擴散，嚴重危害公共安全和威脅人類健康，減少耐藥菌株的生成和研制新的抗菌藥物不僅成為醫藥界必須解決的重大問題，而且引起了國際社會和各國政府的高度關注。2014年，WHO首次發布了全球抗生素耐藥報告；2016年，聯合國在紐約聯合國總部召開“抗生素耐藥性問題高級別會議”，WHO再次發布報告，全面審視了全球的耐藥菌情況。2016年在杭州舉行的二十國集團（G20）領導人峰會，專門提出要推動全球應對抗生素耐藥性問題。美國、中國等國家高度重視耐藥菌的危害和防控，美國政府2015年制定了為期5年的抗擊耐藥細菌國家行動計劃；中國政府制定了《遏制細菌耐藥國家行動計劃（2016 —2020 年）》。耐藥菌感染，已經成為危害世界公共安全和人類健康的重大疾病。 （2）中醫藥防治感染性疾病具有確切的療效和明顯的優勢 感染性疾病在中醫典籍中常被稱為外感疾病，有外感熱病、傷寒、溫病、溫疫等稱謂。幾千年來，中醫藥為中國人民的健康，尤其是在預防和控制感染疾病方面做出了重大貢獻。中藥藥效物質研究是中藥實現現代化和國際化的突破口，《“十三五”中醫藥科技創新專項規劃》明確了中藥藥效物質研究是國家中長期重點關注的內容之一，強調發展前沿關鍵技術與創新方法的重要性；同時要求在中醫藥原創思維的指導下，加強系統生物學、合成化學、大數據等多學科前沿技術與中醫藥的深度交叉融合，促進中醫藥研究策略的優化和復雜系統研究方法學上的變革，解決當前中醫藥的研究瓶頸問題。 （3）項目建立了中藥防治耐藥菌創新藥物發現新模式 項目建立了以“方-病證-菌”、“藥-病證-菌”、“有效部位-病證-菌”、“有效成分-病證-菌”和“結構-網絡-靶標”的中藥防治耐藥菌創新藥物發現的新模式，建立了抗耐藥菌創新藥物發現與評價的技術體系和平臺，為解決日益嚴重的細菌耐藥性問題提供新思路、建立新體系、開發新藥物。 抗耐藥菌創新藥物發現新平臺 項目建立中藥防治耐藥菌創新藥物發現新模式，基于計算機輔助設計的防治耐藥菌創新中藥發現；基于高通量高內涵篩選的防治耐藥菌創新中藥發現；基于網絡藥理學的防治耐藥菌創新中藥發現；基于新靶點的防治耐藥菌創新中藥發現，突破了中藥防治耐藥菌新品種的評價技術：基于病證菌模型的創新中藥評價；基于毒效整合的創新中藥評價。 （4）篩選出中藥防治耐藥菌候選藥物兩個 ① 基于“方-病證-菌”、“藥-病證-菌”、“有效部位-病證-菌”理念篩選出中藥五類新藥1個-廣藿香油 通過前期對大量中藥方劑抗耐藥菌活性進行篩選，發現廣藿香在大量具有抗耐藥菌活性的中藥方劑中都有出現，初步活性測試也表明，中藥廣藿香具有較強的抗耐藥菌效價。進一步研究還發現廣藿香水提物和醇提物的抗耐藥菌效果遠不如廣藿香油，因此廣藿香油是廣藿香抗耐藥菌活性的有效部位。 廣藿香油的藥效學研究 針對廣藿香油能“芳香化濕”治療陰道炎的臨床應用，我們通過構建家兔陰道炎模型、大小鼠陰道炎模型、原發性痛經模型、斑馬魚血管損傷模型、多種動物離體子宮模型等，通過細菌篩選、細胞篩選等試驗平臺，借助超高分辨率激光共聚焦顯微鏡、高內涵成像系統、流式細胞儀等先進設備對廣藿香油治療陰道炎的物質基礎、量效關系、藥理作用機理等進行了研究，表明廣藿香油對于陰道炎具較好的治療效果。隨后項目對廣藿香油栓劑的制備工藝、質量標準草案等進行了研究制定，并對藥理作用與毒理進行了評價。 ② 基于“有效成分-病證-菌”理念篩選出抗耐藥菌新藥1個-廣藿香酮共軛取代衍生物（CDPC-B7）片劑 廣藿香酮是廣藿香油的有效成分之一，具有多種生物活性，包括胃腸道調節功能、抗炎和抗菌等作用。經實驗證明，廣藿香酮能夠抑制白色念珠菌（Candida albicans）、新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）、黑根霉菌（Rhizopus nigricans）和其他真菌，體內研究表明對大腸埃希菌（E. coli）和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）均有抑制作用。而且，廣藿香酮單體對棒狀桿菌和金黃桿菌的最小抑菌濃度小于0.098 μg/mL。經藥代動力學研究表明，廣藿香酮具有良好的口服吸收效果。 為了進一步優化藥物抑菌療效，降低毒副作用，我們利用分子對接以及網絡藥理學等方法，研究了廣藿香酮復雜的抗菌作用機制和抗菌作用的靶點。并通過基于靶點藥物設計方法，針對性的設計了一類能與靶點緊密結合的廣藿香酮創新衍生物，并通過借助有機合成方法學手段對化合物合成工藝進行了設計和優化，實現了創新廣藿香酮衍生物庫的構建。隨后通過抗菌活性驗證、片劑制備工藝、質量標準草案等進行了研究制定，并對藥理作用與毒理進行了評價。

該技術屬于微生物農藥行業，使用的是專利菌種，制備工藝重 點解決了黃色籃狀菌分生孢子的發酵培養和與普通助劑生物相容性差的技術難 題，目前國內沒有相關制劑研究和開發。本技術優化了發酵條件，在配方中選 用了生物相容性好的助劑和保護劑，產品穩定性好。生產加工操作相對容易； 黃色籃狀菌可濕性粉劑具備制劑穩定，使用、貯存及運輸方便等特點。黃色籃 狀菌可濕粉劑對花生、棉花等多種作物土傳病害防效顯著，防治對象不容易產青島農業大學科技成果介紹 2017 －57－ 生抗藥性，對人畜及天敵安全，是生產無公害農產品的首選藥劑，經在花生和 棉花上應用，盆栽試驗防病效果 85%以上；田間試驗防病效果 60%以上，增產 10% 以上。 

氟嘧菌酯是農藥殺菌劑，廣泛用于治療水稻，小麥，馬鈴薯，蔬菜，咖啡等作物的枯葉 病。氟嘧菌酯的商標名為，中文商品名，國外專利即將到期。 本課題組已完成氟嘧菌酯原料藥合成，工藝路線先進，有成本和環保優勢，利潤空間大。 目前在進行制劑研究，計劃進行國家批文申請。