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成果簡介： 本項目組于全球首次開發(fā)了基于熒光素酶的系列食源性致病菌快速檢測系統(tǒng)。利用該系統(tǒng)本項目組已實現(xiàn)了金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌O157、奇異變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、肺炎克雷伯氏桿菌的單獨和混合檢測，最低檢測限達10個copy，與熒光定量PCR法相比具有更高的特異性，檢測時間可縮短至2-3小時，且設(shè)備、試劑成本相對較低，與現(xiàn)有系列食源性致病

本發(fā)明涉及一組用于同時檢測腐爛病菌、黃化病植原體和叢簇病菌的三種病原的核酸、試劑盒和檢測方法，其中，用于多重PCR同時檢測三種病原的核酸包括腐爛病菌、黃化病植原體和叢簇病菌的上、下游引物；用于熒光定量PCR同時檢測三種病原的核酸還包括有各病原對應的探針。本發(fā)明還建立了一種比較高效、靈敏的，可同時檢測腐爛病菌、黃化病植原體和叢簇病菌這三種病原的檢測方法。該方法能有效提高檢測的靈敏度，避免假陰性結(jié)果的

本發(fā)明涉及辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)中的幾丁質(zhì)合酶。其氨基酸序列為與如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列在相似性在90％以上，優(yōu)選在95％以上，更優(yōu)選在98％以上且具有與如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。所述辣椒疫霉病菌的幾丁質(zhì)合酶的活性水平能夠調(diào)節(jié)活性孢子囊和活性游動孢子的產(chǎn)量從而影響辣椒疫霉病菌的致病力或寄主的發(fā)病程度。

項目階段:在研

中國科大陳宇星教授、周叢照教授和孫林峰教授課題組合作闡明了金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）胞壁酸（WTA）翻轉(zhuǎn)酶TarGH轉(zhuǎn)運WTA的機制和TarGH特異性抑制劑Targocil的抑制機制。該研究成果在線發(fā)表在微生物領(lǐng)域?qū)I(yè)雜志mBio上。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是主要的臨床致病菌之一，其引發(fā)的感染難以治愈甚至可能致死。由于近年來抗生素濫用，出現(xiàn)了對所有的β-內(nèi)酰胺類藥物都具有抗性的MRSA菌株。研究表明S. aureus細胞壁主要成分WTA是引起耐藥性的關(guān)鍵因素之一。在革蘭氏陽性菌中，WTA是一類共價連接在肽聚糖上的陰離子多聚物。WTA在細菌分裂、生物膜形成、宿主定殖以及細菌感染等過程中起著重要作用。因此，WTA合成路徑中的關(guān)鍵酶是新型抗菌藥物的重要靶點。在S. aureus中，WTA合成前體是N-乙酰葡糖胺修飾的多聚核糖醇長鏈，其通過共價鍵連接在錨定在細胞膜上的脂質(zhì)載體Und-PP上。該Und-PP連接的多聚核糖醇長鏈前體先在細胞內(nèi)完成合成，最后通過ABC轉(zhuǎn)運蛋白TarGH翻轉(zhuǎn)出細胞膜。作為最具潛力的抗生素靶標之一，TarGH及其抑制劑得到廣泛研究。先導化合物小分子Targocil是近期被鑒定出來特異性抑制TarGH效率較高的抑制劑，但是其抑制的分子機制并不清楚。為闡明TarGH轉(zhuǎn)運WTA的機理以及Targocil的抑制機制，作者用冷凍電鏡方法，解析了金黃色葡萄球菌WTA翻轉(zhuǎn)酶TarGH的同源蛋白，來自Alicyclobacillus herbarius菌的TarGH結(jié)構(gòu)。其同源性為50%。TarGH結(jié)構(gòu)總體分辨率為3.9 ?，其核心結(jié)構(gòu)區(qū)域分辨率達到3.6?。由于未結(jié)合ATP，TarGH結(jié)構(gòu)處于開口朝向細胞內(nèi)的構(gòu)象狀態(tài)。基于結(jié)構(gòu)，作者計算出了底物轉(zhuǎn)運通道，通過對組成通道的氨基酸殘基性質(zhì)分析并結(jié)合生理實驗，闡明了底物特異性識別機制。通過結(jié)構(gòu)比對作者提出TarGH及其同源蛋白利用“曲柄連桿”原理來實現(xiàn)底物轉(zhuǎn)運的分子機制。具有類似結(jié)構(gòu)特點的ABC轉(zhuǎn)運蛋白都可以利用這一機制通過相對微小的總體構(gòu)象變化轉(zhuǎn)運較大的底物。作者進一步通過生化實驗和計算機模擬確定了Targocil結(jié)合TarGH的精確位點，并闡明了其抑制TarGH轉(zhuǎn)運胞壁酸的分子機制。

該研究以稻曲病菌富含半胱氨酸蛋白SCRE6為研究對象，證實了SCRE6是稻曲病菌中發(fā)揮重要毒性功能的效應蛋白；通過生化實驗揭示了SCRE6是一個以水稻免疫負調(diào)控因子OsMPK6（Mitogen-Activated Protein Kinase 6）為靶標的酪氨酸蛋白磷酸酶。

本發(fā)明提供了動物源食品致病菌鑒定及其耐藥和毒力基因檢測復合芯片。本發(fā)明提供了用于鑒定動物源食品致病菌、致病菌耐藥基因和/或致病菌毒力基因的探針，由序列1?序列171所示的單鏈DNA分子組成。本發(fā)明實驗結(jié)果表明：本發(fā)明的動物源食品中致病菌鑒定及其耐藥和毒力基因檢測復合芯片，能夠有效的達到同時鑒定細菌及其毒力和耐藥基因的綜合目的。

本發(fā)明公開了一套評測殺菌劑對枝干表層腐爛病菌鏟除效果的方法，涉及植物病害防治藥劑評測方法。具體方法是用腐爛病菌的孢子懸浮液接種蘋果的活體枝條，讓接種枝條在自然條件下生長2~4周后，在接種枝條表面施用待測殺菌劑，施藥1周后，從樹體上剪取處理枝條，破壞芽部及周圍皮層組織，在離體條件下誘導傷口發(fā)病，依據(jù)傷口發(fā)病的百分率，評測殺菌劑的鏟除效果。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)難以評測殺菌劑對潛伏于枝條表層腐爛病菌鏟除

本發(fā)明公開了一套快速檢測蘋果枝條內(nèi)輪紋病菌侵染量的簡易方法，涉及植物體內(nèi)病原菌侵染量的快速檢測技術(shù)。本發(fā)明適用于檢測基部直徑不超過3厘米活體蘋果枝條的帶菌量。具體方法為在待檢測枝條的基部環(huán)剝皮層，寬度2~10毫米；用有效成份含量60g/L~100g/L的百草枯藥液浸泡吸水紙、脫脂棉、棉線或布條，取出瀝干后，纏繞在環(huán)剝口處，用膠帶或塑料膜包嚴；從處理后的第3天開始，檢查記錄處理枝條上發(fā)生病變和未發(fā)生