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本發(fā)明提供了一種單鏈片段抗體-多肽融合蛋白及其應(yīng)用,該蛋白是一種具有結(jié)合 Her2受體和攜帶抗癌siRNA藥物雙向功能的融合蛋白,可以作為抗癌siRNA的藥物 載體。其中,單鏈片段抗體為Her2-ScFv,多肽為魚精蛋白片段多肽。該單鏈片段抗 體-多肽融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示的序列。本發(fā)明構(gòu)建的Her2單鏈片段抗 體與魚精多肽的融合蛋白具有結(jié)合Her2受體和攜帶抗癌siRNA藥物的雙向功能。本 發(fā)明的融合蛋白能把抗癌siRNA藥物定向?qū)肽繕?biāo)癌細(xì)胞中,開發(fā)了非病毒載體工 具,加速RNAi技術(shù)應(yīng)用于臨床。

項(xiàng)目成果/簡(jiǎn)介:本發(fā)明提供了一種單鏈片段抗體-多肽融合蛋白及其應(yīng)用,該蛋白是一種具有結(jié)合 Her2受體和攜帶抗癌siRNA藥物雙向功能的融合蛋白,可以作為抗癌siRNA的藥物 載體。其中,單鏈片段抗體為Her2-ScFv,多肽為魚精蛋白片段多肽。該單鏈片段抗 體-多肽融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示的序列。本發(fā)明構(gòu)建的Her2單鏈片段抗 體與魚精多肽的融合蛋白具有結(jié)合Her2受體和攜帶抗癌siRNA藥物的雙向功能。本 發(fā)明的融合蛋白能把抗癌siRNA藥物定向?qū)肽繕?biāo)癌細(xì)胞中,開發(fā)了非病毒載體工 具,加速RNAi技術(shù)應(yīng)用于臨床。項(xiàng)目階段:成果已轉(zhuǎn)化

本發(fā)明涉及一種TNFSF15可溶性蛋白的純化方法，包括如下步驟：(1).IPTG誘導(dǎo)、(2).菌體裂解、(3).上柱洗脫、(4).除鹽分裝。本發(fā)明純化方案通過(guò)低溫誘導(dǎo)的方式，并且以很低的IPTG誘導(dǎo)濃度，降低蛋白在包涵體中的表達(dá)，提升可溶性蛋白的含量，并用較為溫和的裂解純化方式，提高蛋白的穩(wěn)定性和活性。并且操作簡(jiǎn)便，制作周期短，消耗資源少，方便放大生產(chǎn)。

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院吳益東教授團(tuán)隊(duì)在Bt殺蟲機(jī)制研究方面取得重要進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了Bt殺蟲蛋白對(duì)棉鈴蟲的一種新型“雙通道”殺蟲機(jī)制。 吳益東教授團(tuán)隊(duì)的最新研究發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCC2和ABCC3均為Bt受體，用CRISPR基因編輯技術(shù)分別敲除這兩個(gè)基因，不能獲得Bt抗性；而同時(shí)敲除這兩個(gè)基因后獲得了超過(guò)1.5萬(wàn)倍的極高水平抗性。這意味著，同時(shí)敲除這兩個(gè)基因會(huì)使Bt毒素對(duì)棉鈴蟲的進(jìn)攻完全失效。 吳益東解釋，ABCC2和ABCC3是一對(duì)結(jié)構(gòu)高度相似、功能相互重疊的Bt受體，Bt毒素在尋找受體發(fā)起攻勢(shì)時(shí)，相當(dāng)于獲取了深入敵營(yíng)的“雙重通道”。因此，棉鈴蟲缺失ABCC2和ABCC3中的任何一個(gè)受體均不影響B(tài)t的殺蟲效果，從而限制了棉鈴蟲在ABCC2和ABCC3通路上的抗性進(jìn)化能力。 棉鈴蟲和Bt毒素的攻防之間，存在著相互適應(yīng)、協(xié)同進(jìn)化的復(fù)雜關(guān)系。在Bt毒素對(duì)棉鈴蟲“雙通道”殺蟲機(jī)制的壓制下，棉鈴蟲可以避其鋒芒，在Bt毒素進(jìn)攻薄弱環(huán)節(jié)進(jìn)化出新的抗性機(jī)制。在吳益東教授團(tuán)隊(duì)的前期研究中，發(fā)現(xiàn)了棉鈴蟲為削弱Bt殺蟲能力進(jìn)化出的2種抗性機(jī)制：一種是棉鈴蟲Bt受體HaCad（一種鈣粘蛋白）通過(guò)基因缺失突變，另一種是四跨膜蛋白TSPAN1通過(guò)L31S點(diǎn)突變，在這兩種情況下，棉鈴蟲通過(guò)喪失HaCad的受體功能或增強(qiáng)腸道修復(fù)能力，使Bt抗性顯著增強(qiáng)。 團(tuán)隊(duì)的研究還發(fā)現(xiàn)，我國(guó)棉鈴蟲田間抗性個(gè)體攜帶的抗性基因在2010年前以HaCad突變?yōu)橹鳎?013年后以TSPAN1點(diǎn)突變?yōu)橹鳎形丛谔镩g檢測(cè)到ABCC2和ABCC3突變，其中原因，可能正是這次的研究所揭示的，是ABCC2和ABCC3這一對(duì)功能冗余的受體為Bt毒素的進(jìn)攻提供了相互并聯(lián)的“雙通道”，因此捆住了棉鈴蟲利用這一對(duì)受體發(fā)生變異而逃逸攻擊的“手腳”。

我校萬(wàn)建民院士團(tuán)隊(duì)在植物學(xué)權(quán)威刊物《The Plant Cell》在線出版了題為“GPA5encodes a Rab5a effector required for post-Golgi trafficking of rice storageproteins”的研究成果。 萬(wàn)建民院士團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的谷蛋白后高爾基體分選缺陷突變體gpa5，通過(guò)圖位克隆的方法證實(shí)GPA5編碼一個(gè)具有磷脂結(jié)合能力的植物特有調(diào)控因子。在胚乳細(xì)胞中，GPA5特異分布在致密囊泡外圍。亞細(xì)胞定位分析證實(shí)GPA5的膜定位依賴于前期鑒定的GPA1/Rab5a和GPA2/VPS9a。生化分析進(jìn)一步證實(shí)GPA5可特異與GPA1/Rab5a的激活態(tài)形式互作，表明GPA5可能是GPA1/Rab5a的效應(yīng)子（effector）。后續(xù)的功能研究發(fā)現(xiàn)，GPA5可與栓系復(fù)合體CORVET和含有VAMP727的膜融合復(fù)合體SNARE互作，介導(dǎo)致密囊泡與蛋白貯藏液泡的膜融合，以完成谷蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。 萬(wàn)建民院士團(tuán)隊(duì)以解析水稻谷蛋白合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和沉積的分子網(wǎng)絡(luò)途徑為目標(biāo)，長(zhǎng)期致力于稻米蛋白品質(zhì)改良的分子遺傳基礎(chǔ)研究。本研究是該團(tuán)隊(duì)在《植物細(xì)胞（The Plant Cell）》和《分子植物（Molecular Plant）》等雜志相繼報(bào)道GPA1/Rab5a, GPA2/VPS9a,GPA3和GPA4/Got1B調(diào)控谷蛋白分選后，在稻米蛋白品質(zhì)形成的分子機(jī)理研究中取得的又一重要進(jìn)展，進(jìn)一步豐富了人們對(duì)谷蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)分子網(wǎng)絡(luò)途徑的認(rèn)識(shí)，為稻米蛋白品質(zhì)的改良奠定了理論基礎(chǔ)。

西湖大學(xué)周強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室利用冷凍電鏡技術(shù)成功解析此次新冠病毒的受體——ACE2的全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)。這是世界上首次解析出ACE2的全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)。相關(guān)研究?jī)?nèi)容于北京時(shí)間2月19日凌晨3點(diǎn)左右在預(yù)印版平臺(tái)bioRxiv上線。這也是西湖大學(xué)承擔(dān)的浙江省新型冠狀病毒肺炎防治應(yīng)急科研攻關(guān)任務(wù)的重要成果。 新型冠狀病毒感染引發(fā)的肺炎疫情爆發(fā)后，武漢病毒研究所的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，新型冠狀病毒和2003年的SARS病毒一樣，也是通過(guò)識(shí)別ACE2蛋白進(jìn)入人體細(xì)胞的，ACE2是“新冠病毒”侵入人體的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，在SARS病毒和“新冠病毒”侵入人體的過(guò)程中，ACE2就像是“門把手”，病毒抓住它，從而打開了進(jìn)入細(xì)胞的大門。 周強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室針對(duì)這個(gè)問(wèn)題進(jìn)行了攻堅(jiān)。第一步，他們要獲取ACE2蛋白全長(zhǎng)蛋白，但作為膜蛋白的ACE2本身很難在體外穩(wěn)定獲得。周強(qiáng)及博士后鄢仁鴻在文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)ACE2與腸道內(nèi)的一個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B0AT1能夠形成復(fù)合物。根據(jù)他們過(guò)去的研究經(jīng)驗(yàn)，這個(gè)復(fù)合物極有可能穩(wěn)定住ACE2。果然，他們通過(guò)共表達(dá)的方法獲得了ACE2與B0AT1優(yōu)質(zhì)穩(wěn)定的復(fù)合物，并利用西湖大學(xué)的冷凍電鏡平臺(tái)成功解析了其三維結(jié)構(gòu)，分辨率達(dá)到2.9埃，對(duì)于病毒識(shí)別至關(guān)重要的胞外結(jié)構(gòu)域分辨率為2.7埃。通過(guò)分析ACE2的全長(zhǎng)蛋白結(jié)構(gòu)，周強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)ACE2以二聚體形式存在，同時(shí)具有開放和關(guān)閉兩種構(gòu)象變化，但兩種構(gòu)象均含有與冠狀病毒的相互識(shí)別界面。一研究發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步解析全長(zhǎng)ACE2和新冠病毒的S蛋白復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明公開了一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3編碼的核酸序列，所分離出的DNA分子包括：編碼具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3活性的多肽核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ？ID？NO：1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者該核苷酸序列能在40-55℃條件下與SEQ？ID？NO：1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明還同時(shí)公開了一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽Pp-AP3，其具有SEQ？ID？NO：2所示的氨基酸序列。本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3具有抗菌性能。

本發(fā)明公開了一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5編碼的核酸序列，所分離出的DNA分子包括：編碼具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5活性的多肽核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ？ID？NO：1中從核苷酸第329-454位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者該核苷酸序列能在40-55℃條件下與SEQ？ID？NO：1中從核苷酸第329-454位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明還同時(shí)公開了一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5，其具有SEQ？ID？NO：2所示的氨基酸序列。蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP5具有抗菌性能。

-5,8,11,14-二十碳四烯酸，是屬于ω-6系列的一種人體必需的多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，具有廣泛的生物活性和重要的營(yíng)養(yǎng)作用。ARA不僅是機(jī)體組織細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)成分，同時(shí), 它也是內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起重要作用的前列腺素、環(huán)前列腺素和白三烯類等二十碳衍生物的直接前體。另外，ARA也是成熟母乳成分之一，它對(duì)嬰兒的視力和智力發(fā)育是必需的。因此，英國(guó)營(yíng)養(yǎng)基金會(huì)和FAO/WHO推薦在嬰兒奶粉中添加DHA和ARA。ARA及其代謝產(chǎn)物的生理功效還包括：在細(xì)胞內(nèi)可發(fā)揮第二信使作用，參與造血和免疫調(diào)節(jié)，引起血管舒張，參與肝、膽多種功能的調(diào)節(jié)，引起炎癥反應(yīng)及參與神經(jīng)內(nèi)分泌和促進(jìn)細(xì)胞分裂等。在水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)方面，ARA是許多魚類幼體、對(duì)蝦幼體的必需脂肪酸，關(guān)系到幼體的生長(zhǎng)發(fā)育和存活。餌料中添加ARA，可提高投喂動(dòng)物的生長(zhǎng)速度和存活率。藻膽蛋白是某些藻類特有的重要捕光色蛋白,早在上個(gè)世紀(jì)初,就曾報(bào)道在藍(lán)藻和紅藻中存在強(qiáng)烈熒光性的紅色、紫羅藍(lán)色和藍(lán)色蛋白質(zhì)。科學(xué)研究表明，藻膽蛋白是一種既可以作為天然色素用于食品、化妝品、染料等工業(yè)上，也可制成熒光試劑，用于臨床醫(yī)學(xué)診斷和免疫化學(xué)及生物工程等研究領(lǐng)域中。另外，還可以制成食品和藥品用于醫(yī)療保健上，應(yīng)用范圍廣闊，具有很高的開發(fā)、利用價(jià)值。藻膽蛋白主要存在于藍(lán)藻、紅藻、隱藻和少數(shù)一些甲藻中 ,其主要功能是作為光合作用的捕光色素復(fù)合體 ,在一些藻類中藻膽蛋白也可以作為儲(chǔ)藏蛋白 ,以使藻類在氮源缺乏的季節(jié)得以生存。已知的藻膽蛋白主要可以分為以下4大類：藻紅蛋白(Phycoerythrin,PE)、藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin,PC)、藻紅藍(lán)蛋白(Phycoerythrocyanin,PEC)、別藻藍(lán)蛋白(Allophyxoxyanin,APC)。

以經(jīng)典的LDE分子4-羥基壬烯醛（HNE）為模型，結(jié)合還原性二甲基化標(biāo)記技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)外源的羰基化修飾蛋白和位點(diǎn)進(jìn)行了直接的大規(guī)模捕獲和鑒定 (Redox Biol 2017,12, 712-718)。然而鑒定病理?xiàng)l件下內(nèi)源性羰基化的修飾蛋白及位點(diǎn)仍是該領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。為了解決這一難題，王初課題組首次將廣泛應(yīng)用于oxime ligation中的催化劑苯胺結(jié)構(gòu)引入到活性分子探針中，首先以HNE為模型分子，建立和優(yōu)化了蛋白羰基化修飾的定量化學(xué)蛋白質(zhì)組方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)上千個(gè)羰基化修飾位點(diǎn)的修飾活性的定量分析。