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本發(fā)明提供了用于檢測禽白血病病毒J亞群(ALV?J)的試劑盒，屬于RT?PCR檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒含有一對特異性引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1?2所示。本發(fā)明還提供了檢測禽白血病病毒J亞群的方法。本發(fā)明試劑盒和檢測方法具有高特異性、高靈敏度、高效率、通用性好、低成本的特點，可在6.5h內(nèi)對臨床病料進(jìn)行快速鑒別診斷，本發(fā)明為ALV?J的早期快速診斷和開展分子流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)手段，以更好地指導(dǎo)養(yǎng)禽生產(chǎn)中對該病的防控。

成果先后獲省級科技進(jìn)步一等獎、國家科技進(jìn)步二等獎。試劑盒可用于禽白血病流行病學(xué)調(diào)查和種禽禽白血病的凈化與根除，具有簡便快速，特異性高，費用低，適于大規(guī)模檢測等特點。

癌癥已成為公眾健康的重大殺手，每年因癌癥死亡的人數(shù)接近1000萬，傳統(tǒng)的放療、化療由于過高的毒副作用，外科手術(shù)部位有限而難以有效治療，靶向藥物的發(fā)展極大推動了腫瘤治療，然而也存在易產(chǎn)生耐藥性等問題。免疫療法作為新興的腫瘤治療策略，具有精準(zhǔn)打擊、低毒副作用、不易產(chǎn)生耐藥等優(yōu)點逐步受到關(guān)注，其中溶瘤病毒能夠選擇性在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制而不破壞正常細(xì)胞，因而具有很大的應(yīng)用前景（詳細(xì)內(nèi)容見前期推送科普系列——溶瘤病毒腫瘤治療）。目前許多溶瘤病毒以實體瘤為治療靶標(biāo)，而應(yīng)用于血液腫瘤的成功案例卻很少。近日，吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院于湘暉課題組在國內(nèi)主辦的SCI雜志Signal Transduction and Targeted Therapy上在線發(fā)文，題為“Enhancing the antitumor activity of an engineered TRAIL-coated oncolytic adenovirus for treating acute myeloid leukemia”，該研究構(gòu)建了表達(dá)TRAIL融合蛋白的溶瘤腺病毒，與人參皂苷Rh2聯(lián)用，實現(xiàn)選擇性殺傷血液腫瘤，為白血病的治療提供了新思路。急性髓系白血病（AML）是髓系造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的惡性病變，原始細(xì)胞異常增生、分化。盡管一線治療、鞏固化療的方案能夠完全緩解許多患者病癥，但是仍有部分患者無明顯療效，還有一些患者存在復(fù)發(fā)情況，亟需新的治療方式。之前的研究中，研究者曾構(gòu)建了表面展示腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）的腺病毒，能夠結(jié)合腫瘤表面死亡受體DR4和DR5，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減弱病毒肝臟趨向性。為了更好評估病毒載體的感染與復(fù)制造成的影響，研究者通過流式細(xì)胞儀分析了病灶內(nèi)分離的AML細(xì)胞上的TRAIL受體（死亡受體DR4/5、誘餌受體DcR1/2）和腺病毒受體（CAR、整合素 αvβ3 和整合素αvβ5），發(fā)現(xiàn)多數(shù)表達(dá)中等水平TRAIL受體，培養(yǎng)細(xì)胞系也有類似現(xiàn)象，而正常粒細(xì)胞、T細(xì)胞這兩類受體表達(dá)很低，因此選擇TRAIL表面展示腺病毒能夠較好進(jìn)行靶向治療。研究者為構(gòu)建溶瘤腺病毒，通過將腺病毒A3衣殼蛋白IX插入“拉鏈結(jié)構(gòu)”，使得TRAIL能夠與“拉鏈結(jié)構(gòu)”偶聯(lián)展示在衣殼蛋白表面。由于只有約17%的衣殼蛋白連接上了TRAIL，研究者試圖采用新的策略：在大腸桿菌中表達(dá)可溶性TRAIL-“拉鏈結(jié)構(gòu)”融合蛋白，再將可溶性的蛋白與病毒粒子孵育，離心后分離表面覆蓋可溶性TRAIL的腺病毒粒子。通過變性凝膠電泳、高效液相色譜、斑點雜交等證實了改造的腺病毒zA4載有活性更高的TRAIL。細(xì)胞實驗也證明zA4相較于原來的版本A3、A4侵染能力、特異性顯著提高。細(xì)胞結(jié)合試驗用于評估侵染活性，證明了攜帶TRAIL顯著促進(jìn)了腺病毒的內(nèi)吞；定量PCR試驗用于評估病毒復(fù)制能力，zA4在癌細(xì)胞中復(fù)制顯著強(qiáng)于其他載體。為有效評估zA4載體抗白血病活性，在不同感染復(fù)數(shù)下以不同載體侵染培養(yǎng)AML細(xì)胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)zA4顯著誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡。對臨床分離原代AML細(xì)胞深入探究，zA4顯著抑制了大部分AML細(xì)胞的增殖，然而值得注意的是，少部分不表達(dá)死亡受體的細(xì)胞無明顯變化。溶瘤病毒能否在體內(nèi)發(fā)揮作用直接決定了其是否具有臨床價值，基于之前的細(xì)胞實驗，研究者對皮下移植造模小鼠注射了腺病毒載體，發(fā)光成像和病毒基因組分析均證實了載體腫瘤組織靶向性。zA4處理小鼠顯著抑制腫瘤生長，正常器官組織形態(tài)學(xué)、生化特征均未變化，因此未產(chǎn)生肝損傷。同時還觀察到凋亡重要因子caspase-3水平顯著上調(diào)。在更加真實的小鼠白血病模型中，也觀察到相似的結(jié)果，病毒在腫瘤消失后也并不會長時間存在。然而總有一些原代AML細(xì)胞TRAIL表達(dá)量很低，影響zA4的效果。聯(lián)系之前的研究，人參皂苷Rh2能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞死亡受體表達(dá)和細(xì)胞毒性，研究者就試圖通過Rh2增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。通過IC50測定、信號通路分析證實了存在協(xié)同效應(yīng)，在細(xì)胞、小鼠水平上都得到了證實，兩者聯(lián)合使用促進(jìn)白血病腫瘤的凋亡。該研究通過優(yōu)化載體結(jié)構(gòu)、聯(lián)合用藥等方式增強(qiáng)了溶瘤腺病毒的活性，拓寬了溶瘤病毒的潛在適應(yīng)癥范圍，后續(xù)深入的分子機(jī)制探究以及療效的評估將有助于為白血病治療開辟新的道路。

本項目屬于醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。以兒童最常見的腫瘤性疾病—白血病為研究對象，全面深入地探討了白血病與鐵代謝之間的關(guān)系。鐵是細(xì)胞生長所必需的元素之一，在能量代謝、DNA合成以及細(xì)胞調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本學(xué)科在國內(nèi)率先致力于鐵代謝的基礎(chǔ)和臨床研究，30余年來在小兒缺鐵性貧血及母胎（嬰）鐵代謝研究領(lǐng)域取得了突出的成就，居國內(nèi)領(lǐng)先地位和國際先進(jìn)水平。 近10年來，本學(xué)科將鐵代謝的研究拓展和深入到白血病腫瘤學(xué)領(lǐng)域，在國內(nèi)首次以白血病細(xì)胞株和小兒急性白血病患者為研究對象,從多個角度和不同層面深入研究了白血病細(xì)胞鐵代謝異常的特點和規(guī)律，首先在分子水平探討了鐵調(diào)節(jié)蛋白、線粒體鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在白血病發(fā)病中的作用和機(jī)制；進(jìn)而研究了鐵剝奪對白血病細(xì)胞原癌基因、多藥耐藥基因、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及凋亡酶等方面的一系列影響；研究了鐵代謝相關(guān)指標(biāo)在白血病診斷和預(yù)后判斷中的意義。在白血病細(xì)胞鐵代謝研究領(lǐng)域取得了新的突破和進(jìn)展。 本項目已在國內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物發(fā)表論文30篇，其中國家級權(quán)威期刊和核心期刊發(fā)表21篇，國際雜志發(fā)表1篇，其論文已被國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫收錄多篇和引用。研究結(jié)果多次參與國際及全國性學(xué)術(shù)會議交流，產(chǎn)生了積極的學(xué)術(shù)影響。本項目的研究促進(jìn)了學(xué)科的建設(shè)和人才培養(yǎng)，已培養(yǎng)博士、碩士研究生共20余名。目前，全國范圍內(nèi)已有我們培養(yǎng)的研究生繼續(xù)深入該領(lǐng)域的研究，發(fā)表了高水平的學(xué)術(shù)論文。本項目已指導(dǎo)部分醫(yī)院開展白血病相關(guān)鐵代謝指標(biāo)的檢測及指導(dǎo)臨床診斷和治療，從而產(chǎn)生顯著的社會和經(jīng)濟(jì)效益。

雄黃本身是一種水不溶性硫化砷礦，具有劑型單一、生物利用率低、臨床用量大等缺點。基于此，我們以甘肅優(yōu)質(zhì)道地礦物藥雄黃為主要原料，成功的借助特定微生物的生物化學(xué)催化作用，建立起一套成熟的針對雄黃的微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，將雄黃中的砷溶解出來，得到一種新型砷劑。通過藥理藥效實驗證實，該新型砷劑可以有效的通過阻滯細(xì)胞周期，在體內(nèi)外誘導(dǎo)小鼠腹水瘤S180和肝癌細(xì)胞H22發(fā)生凋亡。同時，對荷瘤小鼠的毒副作用較小，對腫瘤組織具有很強(qiáng)的選擇性。尤其對多種（多藥耐藥）白血病有良好的體外抑制作用。目前實驗證實，與雄黃相比

創(chuàng)制出了一種基于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的血清 4 型禽腺病毒滅活苗。通過懸浮培養(yǎng)技術(shù)，該血清 4 型禽腺病毒效價可達(dá)到 109 TCID50/ml，是傳統(tǒng)雞胚培養(yǎng)獲得的病毒效價的 100 倍。動物免疫效果表明，免疫后 21 天攻毒，非免疫對照組雞均全部死亡，觀察期內(nèi)發(fā)病雞多表現(xiàn)精神沉郁、羽毛粗亂、食欲不振，剖檢可見心包積液、肝臟病變等相關(guān)組織病變；免疫組均為 100%保護(hù)，觀察期內(nèi)未見任何異常現(xiàn)象，剖檢未見腺病毒相關(guān)組織病變。高效價血清 4 型禽腺病毒滅活苗的研制可大大降低疫苗的成本，提供疫苗免疫效果，具

本發(fā)明提供一種白血病噬菌體單鏈抗體庫，以噬菌粒pCANTAB-5E為載體，庫容達(dá)到1.5×109，經(jīng)DNA測序證明其多樣性良好。從該全人源白血病單鏈抗體庫中，通過噬菌體展示技術(shù)，以特定的白血病相關(guān)抗原為靶標(biāo)，經(jīng)過多輪淘篩，可以方便地獲得白血病細(xì)胞特異的全人源單鏈抗體。本發(fā)明提供的抗體庫的庫容量大，多樣性良好；包含全套人類單鏈抗體的組合；單鏈抗體由重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL通過連接肽(GGGGS)3連接而成，且含有完整的抗原結(jié)合部位。所述方法可操作性強(qiáng)，庫容量大，可方便地篩選出對白血病特異的全人源單鏈抗體，這些全人源單鏈抗體可制備為靶向藥物，用于白血病的治療。

雄黃本身是一種水不溶性硫化砷礦，具有劑型單一、生物利用率低、臨床用量大等缺點。基于此，我們以甘肅優(yōu)質(zhì)道地礦物藥雄黃為主要原料，成功的借助特定微生物的生物化學(xué)催化作用，建立起一套成熟的針對雄黃的微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，將雄黃中的砷溶解出來，得到一種新型砷劑。通過藥理藥效實驗證實，該新型砷劑可以有效的通過阻滯細(xì)胞周期，在體內(nèi)外誘導(dǎo)小鼠腹水瘤 S180 和肝癌細(xì)胞 H22 發(fā)生凋亡。同時，對荷瘤小鼠的毒副作用較小，對腫瘤組織具有很強(qiáng)的選擇性。尤其對多種（多藥耐藥）白血病有良好的體外抑制作用。目前實驗證實，與雄黃相

雞新城疫、禽流感、Ⅰ群禽腺病毒是影響?zhàn)B禽業(yè)發(fā)展的三種傳 染性疫病，這三種傳染性疫病在我國很多地區(qū)的養(yǎng)雞場同時存在，給養(yǎng)禽業(yè)造 成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)團(tuán)隊一直致力于疫病的流行動態(tài)規(guī)律 及病毒變異情況跟蹤調(diào)查。通過長期流行病學(xué)調(diào)查、病毒分離鑒定及對各地流青島農(nóng)業(yè)大學(xué)科技成果介紹 2017 －34－ 行毒株的保護(hù)效果等分析研究，最終篩選出與流行毒株同源性高、免疫原性好 且有自主知識產(chǎn)權(quán)的病毒毒株作為制苗用毒株。根據(jù)疫病流行情況開展了雞新 城疫、禽流感（H9 亞型）、禽腺病毒（Ⅰ群，4 型）三聯(lián)滅活疫苗的研究工作， 在完成了毒種、生產(chǎn)工藝、安全、效力、免疫期、保存期、中間試制等研究基 礎(chǔ)上獲得了詳實的試驗數(shù)據(jù)。該產(chǎn)品具有廣闊的市場應(yīng)用前景。 

白血病是危害青壯年的最主要惡性腫瘤之一，化學(xué)治療目前仍然 是白血病的最主要治療方法，但化療中抗癌藥物誘導(dǎo)的藥物耐受性， 特別是獲得性多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現(xiàn)象是阻礙白 血病治療效果的主要障礙，也是目前尚未解決的難題。三氧化二砷是 中藥砒霜的有效成分，已在各型白血病和實體腫瘤的治療中得到廣泛 應(yīng)用，取得了良好的臨床療效。研究證實三氧化二砷不是耐藥蛋白 P-gp 的底物且抑制 P-g