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Thiotert（研究代號命名YLS004）是浙江大學藥學院余露山教授研究開發的抗腫瘤新藥，研究表明，其同時具有硫氧還蛋白-1（Trx-1）、端粒酶和抗代謝抗腫瘤機制等多靶點協同增效作用。體內外研究結果表明，Thiotert對結直腸癌、黑色素瘤和白血病等具有顯著的療效，與多種臨床一線用藥相比在藥效和毒性方面表現出明顯的優勢。該新藥已獲得專利授權（ZL201811003442.6），并獲得國內同行專家的高度評價，獲得浙江省重點研發計劃專項（2020C03045）和中國藥學會-以嶺生物醫藥創新基金（2020年）的資助。目前，該候選新藥正在洽談融資擬進行臨床前申報研究。 以下是Thiotert針對硫氧還蛋白-1和端粒酶兩個靶點的相關材料，其對白血病的研究還在進行中，結果未整理到該文件。 （一）國內外研究現狀和發展趨勢。 據2019年1月我國最新的癌癥統計數據顯示，2015年（統計數據晚3年）我國惡性腫瘤發病約392.9萬人，死亡233.8萬人，惡性腫瘤死亡占居民全部死因的23.9%。而2018年全球范圍內有1810萬癌癥新發病例和960萬癌癥死亡病例。由于腫瘤的高度異質性，一些抗腫瘤藥物只能對某種或是某類腫瘤有效，而且隨著重復給藥的進行又非常容易耐藥。同時，許多腫瘤特別是耐藥性腫瘤常需要兩種或多種化療藥物聯合用藥后才能被有效抑制。這說明，這些腫瘤需要從多個靶點同時給藥才能起到良好的抑制療效。因此，針對雙/多靶點協同的抗腫瘤藥物設計是抗癌新藥研發的熱點。   1. 硫氧還蛋白-1及抗癌藥物研究 硫氧還蛋白-1（Thioredoxin-1，Trx-1）是一種促進腫瘤生長，抑制細胞凋亡，能上調低氧誘導因子HNF-1α和血管內皮生長因子VEGF的低分子量的細胞氧化還原蛋白。在乳腺癌、宮頸癌、肺癌、肝癌，結直腸癌、胃癌和黑色素瘤等腫瘤病人的血液和癌組織中Trx-1的濃度都較正常人體中顯著升高。Trx-1在腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性方面發揮著重要的作用，如Trx-1含量越高的成人T細胞白血病細胞對阿霉素的敏感性越低，多烯紫杉醇敏感的MCF-7乳腺癌細胞轉染Trx-1基因后對多烯紫杉醇耐藥，而敲低膀胱癌和前列腺癌細胞中Trx-1后顯著增加它們對絲裂霉素C的敏感性等。因此，Trx-1靶點是抗腫瘤藥物設計的熱門靶點。 雖然目前臨床上還沒有針對該靶點的上市新藥，但是已有多個候選新藥正在臨床研究中。比如，由北京大學研發的乙烷硒啉正在進行臨床II期研究（登記號CTR20140581），其是通過抑制硫氧還蛋白還原酶進而抑制Trx-1水平，臨床定位胃癌、肺癌和結腸癌。莫特沙芬釓也是一種針對該靶點的候選新藥，目前正在進行臨床III期，對腦癌具有顯著的療效。金諾芬是一種廣泛用于治療類風濕性關節炎的藥物，但研究發現其可通過Trx-1靶點對多種腫瘤發揮顯著療效，目前美國同步開展了4個臨床試驗對金諾芬進行抗腫瘤藥效的二次開發（臨床登記號NCT01419691，NCT01737502，NCT017477798和NCT03456700）。 PX-12（1-甲基丙基-2-咪唑基二硫醚）也是一種能抑制Trx-1的新藥分子，其分子中的二硫鍵是該藥物分子與Trx-1發生反應的關鍵活性區域。-Cys-Gly-Pro-Cys-是Trx-1的保守催化位點，其主要通過Cys32和Cys35兩個半胱氨酸殘基發揮功能。Trx-1能將這兩個半胱氨酸殘基氧化成二硫醚，進而導致Trx-1失活，作用機制如下圖所示。 臨床前研究數據表明，PX-12對乳腺癌細胞MCF-7和胃腸道癌如結直腸癌細胞HT-29具有顯著的抑制作用。I期臨床試驗數據顯示，PX-12能劑量依賴性有效降低多種腫瘤病人循環血液中Trx-1和VEGF水平，并與腫瘤病人的生存期具有明顯的相關性。按300 mg/m2/天的給藥劑量連續三天靜脈注射給與腫瘤病人志愿者，病人僅出現了1-2級的副作用，沒有出現3和4級的副作用，報道的副作用為可逆性缺氧和肺炎。以上結果提示，PX-12不但具有顯著的抑瘤效果，同時臨床副作用很小，顯示良好的抗腫瘤開發前景。 2. 端粒酶及抗癌藥物研究 端粒位于真核線性染色體末端，其作用是保持染色體的完整性和控制細胞分裂周期。由于“末端復制問題”、氧化損傷和其他復制相關的末端處理事件，端粒在正常體細胞每輪DNA復制中會逐漸縮短。端粒酶通過在細胞中的線性染色體末端添加六聚體端粒DNA（TTAGGG）重復來減少端粒縮短。因而，在端粒酶陰性的細胞中，因為端粒縮短，細胞會進行復制性衰老，但在端粒酶陽性的細胞中，細胞會永生化，有可能發展為癌癥。除了生殖細胞，干細胞，激活的淋巴細胞外，大多數正常的人體細胞不具有端粒酶活性，但在約85％至90％的原發性人類癌癥中幾乎普遍檢測到它。因此，通過抑制端粒酶活性就能抑制腫瘤的無限繁殖，許多的研究致力于尋找有效的端粒酶抑制劑。 國內外針對端粒酶抑制劑的研究主要包括4個方面：抑制端粒酶活性，抑制端粒酶的疫苗，抑制端粒酶的病毒，以及破壞端粒完整性。目前，雖然還沒有針對端粒酶的上市藥物，但是已有多個候選藥物正在進行臨床前研究和臨床各期試驗，分別是GRN163L，GV1001，GRNVAC1，G-quadruplex ligands和TERT promoter-driven oncolytic virus等。然而，這些候選藥物都是大分子化合物。 學術期刊Cancer Discovery（IF 26.37）報道了一種有效的小分子端粒酶抑制劑6-硫代-2'-脫氧鳥苷（6-thio-2′-deoxyguanosine，6-thio-dG），它可被端粒酶識別，并被整合到從頭合成的端粒中，導致端粒功能障礙，抑制腫瘤增殖（Cancer Discov, 2015, 5: 82-95）。這是至今為止報道的唯一一個小分子端粒酶抑制劑。據最新的Clarivate Analytics新藥研發進度網站查詢，預計6-thio-dG將在2019年第3季度進入臨床I期試驗階段。已有的臨床前研究結果表明，6-thio-dG對I/O-、BRAF-、EGFR靶向治療難治性腫瘤具有廣泛的抑制作用，尤其對結直腸癌、肺癌、惡性黑色素瘤具有明顯的療效。特別是，在靶向分子療法中6-thio-dG能透過小鼠血腦屏障，選擇性殺死不可治愈類型兒童腦癌，包括固有橋腦膠質瘤，高級膠質瘤和高危髓母細胞瘤，表現出非常好的效果。 綜上所述， Trx-1和端粒酶在大多數腫瘤中的表達都顯著提高，因此針對這兩個靶點的抗癌藥物可能具有廣譜抗癌作用。由于腫瘤的異質性，多靶點聯合用藥對大部分腫瘤特別是耐藥性腫瘤常表現明顯的效果，是臨床化療的主流方案。為此，我們提出了這樣一個假設，能否將這兩種治療靶點設計在同一個化合物上，讓它同時具有Trx-1和端粒酶抑制作用，從而達到協同抑制腫瘤的效果呢？依據這一個思路，我們前期對PX-12和6-thio-dG母核進行了結構修飾，獲得的新化合物對結直腸癌和黑色素瘤具有顯著的抑制作用，且經評估成藥性好，具有良好的開發前景。   （二）項目主要研究開發內容、關鍵技術及主要創新點。 1.研究成果和研發內容 1.1.已有研究成果 按照上述研究思路，我們設計了4個目標化合物，結構如下：   對這些化合物初步的性狀研究發現，它們為乳白色粉末，對光較為穩定。具有良好的溶解度，其中YLS004在水溶液中的溶解度遠大于10 mg/mL，適合做成粉針劑。 體外機制實驗結果表明，這4個化合物都保留了較好的Trx-1活性抑制作用，其中YLS004的抑制作用與PX-12相當，結果見表1。同時，YLS002和YLS004保留了與6-Thio-dG的端粒酶逆轉錄酶（TERT）抑制作用以及對DNA和端粒的損傷作用，作用略強于對照化合物，見圖1。以上結果表明，我們設計的化合物同時保留了Trx-1活性抑制和端粒酶抑制作用，與預期結果一致。 表1.  2-脫氧鳥苷類衍生物的Trx-1活性抑制作用 化合物 YLS001 YLS002 YLS003 YLS004 6-thio-dG PX-12 克拉屈濱 IC50（μM） 31.71 9.78 47.73 4.26 >100 2.50 >100   圖1. YLS002和YLS004對端粒酶逆轉錄酶（TERT）的抑制以及對DNA和端粒的損傷作用。圖A和B為在人結腸癌細胞HCT116和黑色素瘤細胞A375上YLS002和YLS004對TERT的抑制作用；圖C為對DNA和端粒的損傷作用。 以6-thio-dG、PX-12和上市結構類似抗癌藥物克拉屈濱（Cladribine）作為陽性對照藥，受試化合物對人結腸癌細胞HCT116、SW620、HT29和人惡性黑色素瘤細胞A375都具有顯著的抑制作用，特別是YLS004其抑制作用都優于陽性對照藥物，而對正常結腸上皮細胞未表現抑制作用，結果見表2。而且，YLS004對HCT116和A375細胞的IC50值明顯低于6-Thio-dG+PX-12合用組，見圖2。該結果表明，YLS004體現了Trx-1和端粒酶抑制的顯著抑瘤協同作用。 表2.  2-脫氧鳥苷類衍生物的腫瘤細胞生長抑制作用 化合物 IC50（μM） YLS001 YLS002 YLS003 YLS004 6-thio-dG PX-12 克拉屈濱 NCM460 正常結腸上皮細胞 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 HCT116 人結腸癌細胞 1.27 2.66 21.82 1.09 17.50 34.54 28.45 SW620 人結腸癌細胞 0.21 1.71 5.43 0.11 >100 1.68 >100 HT29 人結腸癌細胞 4.55 3.02 7.37 4.24 3.04 3.37 9.44 A375 人惡性黑素瘤細胞 0.60 0.52 3.06 0.37 0.40 2.98 / BGC 胃腺癌細胞 6.09 / / 11.70 >100 / / K562 白血病細胞 9.885 10.134 28.732 15.732 23.342 21.657 7.863 HepG2 肝癌細胞 10~50 <10 10~50 <10 <10 10~50 / A549 肺癌細胞 30.8 13.52 35.79 31.12 33.59 7.43 / MCF7 乳腺癌細胞 / 15.56 / 41.31 >100 >100 >100 Bcap37 乳腺癌細胞 18.24 21.04 35.12 22.77 >100 >100 >100 注：/，表示未進行該組實驗。   圖2. YLS004與6-Thio-dG+PX-12合用組分別對HCT116和A375細胞的抑制作用。 體內HCT116裸鼠荷瘤實驗表明，當給藥劑量以相同摩爾數給藥時，與其他3個受試化合物相比，YLS004具有更好的腫瘤抑制作用，而且顯著優于6-thio-dG和PX-12，見圖3。血液生化指標顯示，該劑量下各組都未見明顯的毒性（見工作基礎4，表3）。以上體內外的研究結果表明，YLS004的分子設計保留了Trx-1和端粒酶抑制作用，藥效上顯示了顯著的雙靶點協同抑瘤作用。 圖3.  HCT116細胞荷瘤鼠模型給藥過程中各組裸鼠體重和腫瘤體積的變化 此外，我們采用人惡性黑色素瘤細胞A375荷瘤鼠模型進一步研究了YLS004對人惡性黑色素瘤的抑制作用。該實驗以人惡性黑色素瘤的臨床一線用藥達卡巴嗪（Dacarbazine，DITC）為陽性對照藥物（其給藥劑量為20.40 mg/kg，相當于10 mg/kg YLS004給藥劑量摩爾數的4倍），同時設置了6-thio-dG + PX-12聯合用藥組（給藥劑量與10 mg/kg YLS004等摩爾劑量）。結果發現，按摩爾數計算，YLS004給藥劑量為陽性對照藥DITC給藥劑量的四分之一時，其抑瘤作用都顯著高于DITC，而且其抑瘤作用也顯著高于同摩爾給藥劑量下6-thio-dG和PX-12聯合用藥組（見圖4）。該結果表明，YLS004的抑制人惡性黑色素瘤活性要顯著高于臨床一線用藥DITC，而且從大鼠體重來看，雖然給藥初期YLS004組體重下降較快，但是給藥6天后體重開始逐漸升高，到給藥13天后，體重明顯超過DITC組、6-thio-dG和PX-12聯合用藥組，表明連續給藥后機體能快速逆轉該毒性。此外，從與6-thio-dG和PX-12聯合用藥組的抑瘤作用和體重變化相比，YLS004比聯合用藥組抑瘤作用顯著增加，而且毒性更低。在ICR小鼠上以25 mg/kg/天的給藥劑量連續給藥5天后，僅在造血系統和脾臟發現了輕微的毒性（見工作基礎7）。以上結果說明，YLS004的對人惡性黑色素瘤的抑瘤作用和毒性都顯著優于6-thio-dG+PX-12兩種藥物的同摩爾劑量物理組合以及臨床一線用藥DITC（4倍摩爾劑量），同樣體現了雙靶點的顯著協同抑瘤作用。 圖4. YLS004對A375細胞荷瘤鼠模型給藥過程中各組裸鼠體重和腫瘤體積的變化 Trx-1和端粒酶在多種腫瘤細胞中都高表達，它們對腫瘤的發生和發展都起著重要的促進作用。本項目設計的目標分子將Trx-1抑制劑和端粒酶抑制劑的共能基團巧妙的設計在一起，獲得了同時具有Trx-1抑制和端粒酶抑制作用的全新小分子化合物YLS004，體內外實驗結果都表明其對結直腸癌和惡性黑色素瘤有非常顯著的抑制作用，且毒性低。大鼠體內的藥代動力學研究數據表明，大鼠靜脈注射YLS004后其在大鼠體內能生成代謝物6-thio-dG，請見工作基礎6。因此，YLS004的體內藥代動力學過程和藥效作用都符合我們對該類分子設計的思路，如下圖所示。相關研究成果已經申請國家發明專利（專利名稱：6-雙硫取代-2’-脫氧鳥苷類化合物及其制備方法和應用，專利申請號201811003442.6）。     據2019年1月發布的癌癥報告，我國2015年（統計報告晚3年）結直腸癌的發病人數是38.7萬人，死亡人數為21.5萬人。我國是全球胃腸道癌癥的高發區，近幾年結直腸癌的發病人數據估算已經遠超該數值。目前臨床上結直腸癌的常用治療方案是5-FU聯合奧沙利鉑或伊立替康，但效果都不佳，特別是對中晚期病人。因此，結直腸癌新藥的市場前景非常好。惡性黑色素瘤雖然臨床上發病率較低，但轉移性惡性黑色素瘤目前臨床上沒有好的治療手段，一線用藥達卡巴嗪療效有限且毒副作用大。因此，開發療效好、毒副作用低的結直腸癌和黑色素瘤治療藥物非常必要，同時也具有廣闊的市場前景。   1.2.研發內容 本項目在前期部分成藥性評價基礎上，將按照新藥臨床前研究指導原則，對候選化合物YLS004開展系統的藥學、藥效學、安全性評價、藥代動力學研究，內容如下： （1）藥學研究：利用正交試驗優化YLS004的合成工藝，確定工藝參數，確定中試工藝研究；開展質量研究，制定藥物質量標準，并開展化合物的穩定性研究；完善YLS004的制劑處方、工藝優化、確定制劑生產工藝參數，進行制劑質量標準研究。 （2）作用機制和藥效學研究：采用重組酶、穩定高表達細胞系、基因Knockdown和化學抑制劑等技術開展Trx-1和端粒酶雙靶點抑制研究，進一步明確作用機制；按照抗腫瘤新藥藥效學研究規范，以5-FU/奧沙利鉑和達卡巴嗪等為陽性藥物，以結直腸癌細胞和黑色素瘤細胞（包括耐藥株）體外模型以及荷瘤鼠模型和PDX模型，系統研究YLS004對結直腸癌和黑色素瘤的抑瘤效果，獲得劑量-藥效關系。 （3）藥代動力學研究：考察YLS004的代謝穩定性以及在動物體內的吸收、分布、代謝和排泄等PK特性，考察其對細胞色素P450酶和藥物轉運體的影響從而評估可能的藥物相互作用。 （4）一般藥理學研究：考察在有效劑量下，YLS004對動物的神經系統、心血管系統、呼吸系統等的作用。 （5）安全性評價研究：完成急性毒性實驗（大鼠和犬）、長期毒性試驗（6，12個月，大鼠和犬）、溶血性、局部刺激性、過敏性試驗等，評價YLS004可能的毒性；進行毒代動力學研究。   2.關鍵技術： （1）目標化合物的高效合成技術——針對二硫鍵基團發展YLS004的綠色高效合成技術，簡化合成工藝，使用廉價、滿足新藥申報要求的原料，提高合成總收率、減少污染排放，滿足新藥申報要求。 （2）硫氧還蛋白和端粒酶抑制機制和藥效評價技術——構建重組酶、穩定高表達細胞系、基因Knockdown等模型研究YLS004對硫氧還蛋白和端粒酶雙靶點抑制的協同作用機制，評價量效關系。   3. 主要創新點 （1）該項目通過巧妙的分子設計，使得Trx-1和端粒酶兩個熱門抗癌藥效靶點在一個分子上同時實現抑制，在細胞和動物模型上獲得了對結直腸癌、惡性黑色素瘤等腫瘤效果顯著的目標化合物YLS004，其藥效明顯優于而毒性明顯低于在研的Trx-1抑制劑、6-thio-dG以及臨床一線用藥。 （2）YLS004具有全新分子結構，已申報國家發明專利（6-雙硫取代-2’-脫氧鳥苷類化合物及其制備方法和應用，專利申請號201811003442.6）和PCT（美國）專利，具有完全自主知識產權。    

本發明提出了一種多芯片對準方法和裝置，將方形芯片置于模具中，模具提供限制芯片移動的邊界，通過離心力使芯片緊靠模具實現對準，最后夾緊轉移。該裝置包括底板和壓板，壓板的上表面連接吸盤，吸盤的中心開有第一通孔，第一通孔連接空心桿；底板的上表面固接有開有方孔的模具，底板的下表面放置于托盤上；托盤中心處開有第二通孔，第二通孔連接空心軸的上端，空心軸的上端開有氣孔，空心軸的下端連接電機；空心軸置于真空腔內，在空心軸側壁開氣孔與真空腔相通。本發明結構簡單，操作方便，效率高，在三維封裝、光電集成等領域有廣泛應用。

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