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1. 痛點問題 紅球菌是具有高抗逆性（耐有機溶劑、耐高溫、耐酸堿）的特殊放線菌，日本30年前首先使用紅球菌高效催化丙烯腈水合生產丙烯酰胺——其聚合產物廣泛用于石油開采、水處理、土壤改良劑等領域——迄今為止仍是工業(yè)生物技術領域最成功的案例之一。開發(fā)紅球菌基因編輯方法，一方面可以實現(xiàn)紅球菌細胞自身性能的按需調控（如敲除副產物基因），解決丙烯酰胺、丙烯酸銨等酰胺、羧酸類大宗/精細化學品生產中的高成本和高排放問題，另一方面有望以紅球菌細胞為普適性宿主，高表達各種外源功能酶，從而實現(xiàn)重組紅球菌全細胞催化技術的普遍應用，尤其是解決手性醫(yī)藥中間體現(xiàn)有制備工藝中路線長、工藝復雜、原子經濟性差、環(huán)境污染嚴重等各種主要問題。但是，作為一種革蘭氏陽性放線菌，紅色紅球菌存在基因組中GC含量高、基因轉化率低、非法重組嚴重等問題，基因組改造困難。目前紅色紅球菌基因組改造主要依賴于自殺質粒介導的同源重組，但自殺質粒轉化效率和單交換成功率很低，正確編輯率更低。因此，迫切需要開發(fā)高效的紅球菌基因組編輯工具。 2. 解決方案 本技術核心成果是一種基于CRISPR（成簇規(guī)律間隔短回文序列）-Cas9（DNA剪切蛋白）技術的紅色紅球菌基因組高效編輯方法。該技術通過紅色紅球菌特有啟動子及質粒元件，首先實現(xiàn)了Cas9蛋白在紅色紅球菌中的表達及切割功能；其次成功規(guī)避了紅球菌的限制修飾系統(tǒng)，將紅色紅球菌基因轉化效率提高了80多倍；接下來，又通過紅球菌重組酶的引入，顯著提高了外源基因在紅色紅球菌中的同源重組效率，最終率先成功建立紅色紅球菌的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，不僅可以實現(xiàn)基因組上目標基因的敲除、替換和改造，也可實現(xiàn)多個基因的同時敲除以及無痕疊加敲除，為紅球菌全細胞催化平臺技術開發(fā)及其在化學品綠色先進制造中的應用奠定了堅實基礎。 合作需求 開展合作開發(fā)、技術許可等，尋求有志于生物制藥、生物合成、石油開采、日化洗滌等不同應用領域進行紅球菌全細胞催化法生產目標產品的企業(yè)合作，尤其是在上述不同領域具有生產和銷售優(yōu)勢或經驗的企業(yè)。

選擇標記轉基因作物已成為近年來植物基因工程技術研究的重點之一，隨著轉基因作物產品的商品化，轉基因植物的生物安全性受到公眾越來越多的關注，尤其是目前抗生素標記基因在植物遺傳轉化過程中的廣泛應用，使人們對這些標記基因可能帶來的潛在危害性心存疑慮，抗性標記基因的存在嚴重地阻礙了轉基因植物的商品化進程和轉化技術本身的有效性。 本項目培育的無抗生素標記基因（可視化標記基因）在建立高效、安全、規(guī)模化的轉基因作物技術體系方面取得突破，以紫色幼芽作為可視篩選標記代替抗生素篩選標記，構建了新型轉化載體

本試驗通過石蠟切片技術對湘軍金魚性腺組織進行切片觀察，發(fā)現(xiàn)9月齡的雄性湘軍金魚精巢中有大量的成熟精子，11月齡的雌性湘軍金魚卵巢中有成熟卵子。 一、項目進展 創(chuàng)意計劃階段 二、負責人及成員 姓名 學院/所學專業(yè) 入學/畢業(yè)時間 洪迪珊 湖南師范大學生命科學學院/生物科學 2018/2022 陳雨薇 湖南師范大學生命科學學院/生物技術 2018/2022 劉雨欣 湖南師范大學生命科學學院/生物科學 2019/2023 馬彤彤 湖南師范大學生命科學學院/生物科學 2019/2023 黃志嫻 湖南師范大學生命科學學院/生物科學 2018/2022 三、指導教師 姓名 學院/所學專業(yè) 職務/職稱 研究方向 劉少軍 湖南師范大學生命科學學院/魚類遺傳育種 教授 魚類遺傳育種 王余德 湖南師范大學生命科學學院/魚類遺傳育種 講師 魚類遺傳育種 四、項目簡介 為探究湘軍金魚的胚胎發(fā)育過程、能育性、倍性以及Chordin A基因在湘軍金魚的雙尾性狀形成過程中的作用，本試驗通過石蠟切片技術對湘軍金魚性腺組織進行切片觀察，發(fā)現(xiàn)9月齡的雄性湘軍金魚精巢中有大量的成熟精子，11月齡的雌性湘軍金魚卵巢中有成熟卵子。試驗通過PHA體內誘導腎細胞制片法對湘軍金魚染色體數(shù)目進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)其染色體數(shù)目為100條。試驗通過PCR技術獲得了Chordin A基因全長，并對其進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)Chordin A基因全2634 bp，其中堿基A共618個，占比23.46%、堿基C共692個，占比26.27%、堿基G共756個，占比28.70%、堿基共568個，占比21.56%。堿基“G+C”占比 54.97%，堿基“A+T”占比45.03%。試驗對湘軍金魚不同組織進行Chordin A基因的熒光定量PCR試驗，發(fā)現(xiàn)Chordin A基因在尾鰭表達量最高。項目成員在進行科學探究的同時深挖湘軍金魚經濟價值，項目組成員多次赴雙峰縣、龍?zhí)镦?zhèn)玉坪村等地進行實地調研,我們發(fā)現(xiàn)觀賞魚行業(yè)是朝陽行業(yè)，發(fā)展迅猛；與此同時湖南省休閑漁業(yè)來勢喜人，但是觀賞魚普遍魚病高發(fā)，變異物種破壞生態(tài)等問題。本項目借助湘軍金魚這一優(yōu)質魚種，通過互聯(lián)網+農副產品的銷售模式，變單一銷售模式為多形式利益聯(lián)合，拉動當?shù)氐慕洕鲩L。我們與村落達成了長期合作的關系。湘軍金魚作為優(yōu)質觀賞魚備受消費者青睞。

可以量產/n該項目屬于作物標記輔助育種技術領域，具體涉及利用抗除草劑基因的油菜化學殺雄制種方法。本發(fā)明的特征包括培育耐受化學殺雄劑的父本材料和無遮擋的化學殺雄步驟。利用化學誘變劑誘變甘藍型油菜種子，在5-6葉期噴施除草劑苯磺隆，初步篩選得到抗除草劑的突變體材料，自交得到穩(wěn)定遺傳的抗除草劑油菜突變體株系，提取油菜突變體株系基因組DNA，擴增得到BnaAHAS1和BnaAHAS3基因片段，其中BnaAHAS3基因片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，在該基因BnaAHAS3第536bp處存在一個

中試階段/n該項目提供一種評價轉基因抗蟲水稻水生環(huán)境安全性的方法，包括如下步驟：轉基因稻田和非轉基因稻田布置和管理；稻田水層和淤泥中外源蛋白的測定，包括樣本預處理和外源蛋白的抽提和測定；稻田水層中浮游生物的分離，包括水樣采集、沉淀分離浮游生物；稻田水層中浮游生物種類和豐度的測定，包括活體鑒定和數(shù)量計數(shù)；轉基因抗蟲水稻的種植對浮游生物的安全性評價，利用分析軟件對浮游生物種類、數(shù)量、發(fā)生時期進行統(tǒng)計分析，得出多樣性指數(shù)、均勻性指數(shù)等參數(shù)，并和常規(guī)稻田進行比較，從而對轉基因抗蟲水稻水生環(huán)境安全性進行評價。

可以量產/n由于香石竹是乙烯敏感植物，在其采后貯藏運輸期間需花費大量的人力物力進行保鮮處理。傳統(tǒng)的保鮮方法多采用含有乙稀抑制劑(如AVG、GVG、AOA)和乙稀拮抗劑(如AgNO3、STS、2,5-NBD)的保鮮劑，或是利用冷藏、氣調等措施，不僅成本高，效果也不盡人意，且易造成環(huán)境污染。本成果運用轉基因沉默理論，通過基因工程的方法抑制香石竹內源乙烯的生物合成，從而達到延長香石竹自然保鮮期的目的，進而達到有效調節(jié)貯運和香石竹市場供應之目的。技術水平：利用轉基因技術獲得了瓶插壽命明顯延長的香石竹切花'M

研發(fā)階段/n基于基因組定點編輯分子育種新技術及其配套軟件。　　成果簡介：本成果含有完整的基于CRISPR/Cas系統(tǒng)介導的基因組定點編輯技術，我們對基因組編輯技術切割活性和脫靶效應進行了優(yōu)化，開發(fā)了完整的sgRNA設計，sgRNA表達載體構建，細胞或在體水平基因組打靶和脫靶檢測等技術。提高基因組定點打靶效率和降低脫靶風險，為基因組定點編輯技術應用于動植物分子育種打開了新的局面。本成果擁有自主知識產權的基因組編輯技術配套軟件，其適用于針對不同物種基因組設計和篩選活性高，特異性強的sgRNA用于動植物分

全面開發(fā)了生脈散抑制 ras 原癌基因過表達中 的新用途，具體涉及在制備抑制 ras 原癌基因過表達的抗腫瘤藥物中的應用。

本發(fā)明提供了一種檢測牛APAF1基因隱性致死突變的方法，涉及分子生物學領域，本發(fā)明方法基于焦磷酸測序技術，采用一對擴增引物、一條通用引物和一條測序引物，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1、2、3、4所示，對牛5號染色體63150400bp位點的單核苷酸多態(tài)性進行分析，結果發(fā)現(xiàn)牛APAF1基因野生型純合子在C堿基處有峰，T堿基處無峰；而致死突變攜帶者在C堿基與T堿基處均有峰。本發(fā)明提供的方法操作簡單，靈敏度高，準確性強，通量高，檢測成本低，可快速檢測APAF1基因隱性致死突變攜帶者的個體，在牛的育種過程中具有重要應用價值。